中藥顯微鑒別技術(shù)_取樣、制片、染色
中藥的顯微鑒定法是利用顯微技術(shù)對中藥進行顯微分析,以確定其品種和質(zhì)量的一種鑒定方法。顯微鑒定主要包括組織鑒定和粉末鑒定,利用顯微鏡來觀察藥材的組織構(gòu)造、細胞形狀及內(nèi)含物的特征、礦物的光學(xué)特性,和用顯微化學(xué)方法,確定細胞壁及細胞內(nèi)含物的性質(zhì)或某些品種有效成分在組織中的分布等,用以鑒別藥材的真?zhèn)闻c純度甚至品質(zhì)。
一、取樣
取樣的代表性直接影響到結(jié)果的判斷準確,因此必須重視取樣的各個環(huán)節(jié)。
(一)對照品
對照品粉末是檢定供試品的參照物,其制備是顯微鑒別的先決條件。有經(jīng)驗者,可自取標本,鑒定后制作,或購買藥材經(jīng)品種基原鑒定。還應(yīng)注意有些藥材的顯微特征受生長年限及環(huán)境的影響,會產(chǎn)生一定的波動,所以對于供試品的產(chǎn)地、采收期、加工方法等也應(yīng)當認真記錄。
(二)供試品
中藥材 原藥材應(yīng)注意基原、產(chǎn)地、規(guī)格的完整性、清潔程度以及有無水跡、霉變或其他物質(zhì)污染等情況,并詳細記錄。
(1)從同批藥材包件中抽取有代表性的檢定用樣品。
(2)對破碎的、粉末狀的或大小在 1cm 以下的藥材,一般藥材 100g-500g;粉末狀藥材25g;貴重藥材5g-10g;個體大的藥材,根據(jù)實際情況抽取代表性的樣品。
(3)將所取有代表性樣品混合均勻,即為總樣品量。
(4)前處理:將供試品撿凈后,用量較小時,可以用乳體或小型電磨粉碎過《中國藥典》6號篩(1.0μm-250μm)備用。
1、中成藥
(1)取樣:從各批號的箱、包、瓶中隨機取樣,記錄好廠家、批號,從各包裝盒中任意取1丸,每批號不得少于3次。各供試品留樣保存,保存期限至少1年。
水丸無包衣時,可直接取2 丸-3 丸,乳缽中研成細粉后,取少量置裁玻片上,滴加規(guī)定的試液,攪拌均勻,使粘結(jié)的細胞、組織分離,再按粉末特征加水合氯醛試液或其他適當試液處理后觀察。
水蜜丸或大蜜丸;可直接用刀片橫向切開取一薄片,或用小鋼鏟取一小塊(約15mg)放置在載玻片上制片觀察。
(1)去包衣:中藥片劑常見包衣為糖衣,隔離層常使用膠漿、糖漿和滑石粉。水丸和糊丸等(掛)衣的材料有滑石、蔗糖、朱砂、雄黃、青黛、百草霜、礞石、赫石等??捎玫镀瑢聞?nèi)?,簡單的辦法也可將片劑或丸劑斷為兩半,直接取內(nèi)心,粉碎進行觀察。
(2)添加劑:為便于觀察,可對中成藥的制造過程中使用的添加劑做適當?shù)那疤幚怼?/p>
除去水溶性干擾物:將檢品置于蒸餾水中研勻,離心處理,取沉淀物檢查。
除去脂溶性干擾物:將檢品滴加適量氯仿,離心處理,取沉淀揮干氯仿后檢查。
除去淀粉,糊化淀粉的干擾:將檢品滴加蒸餾水研勻,置燒杯中煮沸、冷卻,離心處理,取沉淀檢查。
以上操作中,為防止某些顯微特征的流失,應(yīng)進行留樣觀察。
二、制片
(一)制片
1、載玻片與蓋玻片 載玻片與蓋玻片是影響圖像質(zhì)量的因素之一。因載物臺下的聚光器是按使用一定厚度的載玻片設(shè)計的。首先應(yīng)選擇規(guī)格統(tǒng)一的載玻片(厚0.9mm-1.2mm)與蓋玻片(厚0.12mm-0.17mm)。使用前,將載玻片與蓋玻片用無水乙醇浸泡后,用柔軟的綢布或無纖維人造紙揩擦,至表面潔凈無暇。
2、制片 將供顯微觀察的粉末藥材或樣品置于載玻片上,然后加入適宜的試液1滴,用玻璃棒攪勻,用鑷子將蓋玻片沿一側(cè)輕輕放下,使液體自然展勻即可??捎脼V紙吸拭溢出的液體或從蓋玻片邊緣補充液體不足的空隙。
(二)制片按使用試劑分類
1、稀碘液制片 主要用于觀察含淀粉粒。
2、斯氏試液制片 試液由醋酸:甘油:水(1:1:1)組成。用于觀察包括淀粉粒在內(nèi)的所有顯微鑒別特征。
3、水合氯醛制片 水合氯醛試液能滲透組織,使皺縮的細胞膨脹并能溶解淀粉粒、蛋白質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油和葉綠素等,使細胞組織變得透明而清晰。
4、乙醇裝片 在觀察的切片中有菊糖、粘液、樹膠等時,使用95%以上的乙醇。
(三)制片按保存時間分類
1、臨時制片 封藏介質(zhì)一般為流動性液體,不耐久藏。但制作簡易、適用于一般的顯微觀察及顯微化學(xué)反應(yīng)。
2、半永久性制片 在上述臨時制片周圍,直接使用加拿大樹膠,將蓋玻片周圍封嚴,室溫放置 1 天干燥后,置冰箱內(nèi),一般可供 10 年以上觀察使用。封藏介質(zhì)還可以選用半固體的甘油明膠。
3、永久性制片 封藏介質(zhì)一般呈固態(tài),可長期保存,但制作費時,多用于教學(xué)標本。制作方法一般是先將粉末用無水乙醇浸潤,隨后瀝去乙醇,用二甲苯浸潤,再瀝去二甲苯,滴加加拿大樹膠的二甲苯溶液后,自然揮發(fā)干燥固定后即可。
三、染色
為使標本片特征顯著,可根據(jù)細胞壁及細胞內(nèi)含物的性質(zhì),加入不同染色劑染色。常見的顯微化學(xué)反應(yīng)如下(所有試液的配制方法參見《中國藥典》)。
(一)細胞壁性質(zhì)的檢定
1、木化細胞壁,加間苯三酚試液1 滴-2 滴,稍放置,加鹽酸 1 滴,因木化程序不同,顯粉色、紅色或紫紅色。此操作最好在水合氯醛透化后再進行,其效果較好。
2、木栓化或角質(zhì)化細胞壁,加蘇丹III 試液,稍放置或微熱,呈橘紅色至紅色。
3、纖維素細胞壁 加氯化鋅碘試液,或先加碘試液濕潤后,稍放置,再加硫酸溶液(33-50)顯藍色或紫色。
(二)細胞內(nèi)含物性質(zhì)的檢定
1、淀粉粒 加稀碘試液,呈藍色或紫色。
2、糊粉粒 (1)加碘試液,呈黃棕色。(2)加硝酸汞試液,呈磚紅色(材
料中如含有多量脂肪油,宜先用乙醚或石油醚脫脂后進行)。
3、脂肪油、揮發(fā)油和樹脂(1)加蘇丹 III 試液,呈橘紅色,紅色或紫紅色。(2)加90%乙醇、脂肪油和樹脂不溶解(蓖麻油及巴豆油例外),揮發(fā)油則溶解。
4、菊糖 加10%α-萘酚乙醇溶液,再加80%硫酸1滴-2滴,顯紫紅色并很快溶解。
5、粘液 加釕紅試液,呈紅色。
6、草酸鈣結(jié)晶 (1)加稀醋酸不溶解,加稀鹽酸即溶解但無氣泡發(fā)生。(2)加硫酸(1-2)逐漸溶解。片刻后析出針狀硫酸鈣結(jié)晶。
7、碳酸鈣(鐘乳體),加稀鹽酸溶解,同時有氣泡發(fā)生。
8、硅質(zhì) 加硫酸不溶解。
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