不同產(chǎn)地和變型天麻藥材的質(zhì)量及其硫磺熏蒸前后的變化

　　[摘要]：天麻作為硫磺熏蒸較為嚴(yán)重的品種之一，其藥材質(zhì)量問(wèn)題受到人們高度關(guān)注。該文利用全國(guó)8個(gè)主產(chǎn)區(qū)和3種主要變型天麻樣品，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS探討不同產(chǎn)地和變型天麻藥材的質(zhì)量及其硫磺熏蒸前后的變化。結(jié)果表明，硫磺熏蒸處理后，天麻藥材中除了巴利森苷E含量升高外，天麻素、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C這4種成分含量均降低，并且產(chǎn)生了一種新的硫熏標(biāo)志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite。相比于產(chǎn)地來(lái)說(shuō)，不同變型的天麻藥材質(zhì)量差異更大，尤其以紅天麻和烏天麻的質(zhì)量差異最為明顯。此外，吉林產(chǎn)地的紅天麻與其他產(chǎn)地的天麻在天麻素和巴利森苷類成分含量上最低，這可能與其種植方式和氣候環(huán)境等因素有關(guān)。綜合來(lái)看，硫磺熏蒸前后天麻質(zhì)量差異要比不同產(chǎn)地和變型對(duì)藥材質(zhì)量的影響更明顯，這主要?dú)w因于產(chǎn)生了新的硫熏標(biāo)志物。

　　[關(guān)鍵詞]：硫磺熏蒸天麻產(chǎn)地變型質(zhì)量評(píng)價(jià)

　　天麻又名赤箭、定風(fēng)草、獨(dú)搖芝[1]，為蘭科多年生植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，藥食兩用，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，被譽(yù)為“治風(fēng)之神藥”，可用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭痛眩暈、風(fēng)濕痹痛等癥[2]。天麻的化學(xué)成分主要有酚類及其苷類、有機(jī)酸類、甾醇類和多糖類，其中酚類及其苷類是天麻的主要活性成分，如天麻素和對(duì)羥基苯甲醇[3-5]。20世紀(jì)70年代天麻由野生變?cè)耘嗪?，栽培天麻成為主要商品?lái)源，其種植主產(chǎn)地主要分布在云南、四川、貴州、湖北、陜西、河南等地[6]。此外，根據(jù)天麻莖桿顏色又可分為紅天麻、烏天麻和烏紅天麻等不同變型[7]。

　　近年來(lái)，硫磺熏蒸加工方法在中藥材的初加工和貯藏環(huán)節(jié)應(yīng)用普遍，主要起到干燥、防腐、漂白、延長(zhǎng)貯藏期的作用[8-9]。但是硫熏過(guò)量不僅會(huì)殘留大量二氧化硫，還會(huì)嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量[10-12]。硫熏天麻在全國(guó)各產(chǎn)區(qū)是普遍存在的，成為硫熏較為嚴(yán)重的品種之一[13]，其質(zhì)量問(wèn)題受到人們廣泛關(guān)注。然而目前還沒(méi)有一種成熟有效的可替代硫磺熏蒸的方法。目前已有大量關(guān)于硫磺熏蒸對(duì)天麻藥材質(zhì)量的研究[14-16]，然而結(jié)合不同產(chǎn)地和變型對(duì)天麻硫熏前后藥材質(zhì)量變化的研究卻鮮有報(bào)道。本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和代謝組學(xué)對(duì)全國(guó)主產(chǎn)地和主要變型的天麻藥材質(zhì)量及其硫磺熏蒸前后變化進(jìn)行探討，為全國(guó)天麻藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和硫熏對(duì)藥材質(zhì)量影響提供參考。

　　1 材料和方法

　　1.1 樣品

　　新鮮天麻樣品分別采自云南昭通、貴州大方、湖北宜昌、四川廣元、安徽大別山、陜西漢中、河南鄭州和吉林撫松8個(gè)產(chǎn)地，包括烏天麻、紅天麻和烏紅雜交天麻3種變型，即有11份天麻樣品，采集時(shí)間為2016年11月。經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定為蘭科植物天麻G.elata的干燥塊莖，憑證標(biāo)本存放于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。具體樣品信息見(jiàn)表1。

　　1.2 儀器和試劑

　　ACQUITY UPLCTM H-Class系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、EmpowerTM3色譜工作站)，Waters Xevo G2-S QTOF-MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)，BSA224S型分析天平(德國(guó)Satorius公司)，Eppendorf 5810R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

　　對(duì)照品天麻素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110807-201507)，巴利森苷A(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)15082302)，巴利森苷B(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)15082013)，巴利森苷C(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)15082012)，巴利森苷E(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)15081606)，蘆丁(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)140225)。乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)，甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

　　1.3 天麻硫磺熏蒸處理

　　天麻樣品分為對(duì)照組和處理組，其中對(duì)照組為不經(jīng)硫磺熏蒸的新鮮天麻，處理組為硫磺熏蒸處理的天麻。采用課題組前期的硫熏方法，硫磺用量與藥材用量比例為1∶20[17]，以保證藥材徹底熏透。處理組具體操作：取新鮮洗凈的天麻樣品，蒸制10~20min，經(jīng)蒸透斷面無(wú)白心后，取出晾干表面水分。仿照產(chǎn)地農(nóng)民熏蒸過(guò)程，取新鮮天麻放置在自制塑料箱上層，箱體兩側(cè)各開(kāi)一小口，將硫磺放置在瓷盤(pán)中，點(diǎn)燃后放置在塑料箱下層，蓋上頂蓋。硫磺熏蒸2h后取出，50℃烘干，打粉備用。經(jīng)過(guò)硫熏處理后，所有產(chǎn)地和變型的11份天麻均得到一一對(duì)應(yīng)的硫熏和未硫熏樣品，即22批處理后的樣品，每批樣品均為5個(gè)單株重復(fù)。

　　1.4 樣品溶液制備

　　1.4.1 對(duì)照品溶液制備

　　精密稱取適量5種天麻對(duì)照品，加50%甲醇分別制成單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，再分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成混合對(duì)照品溶液，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2 供試品溶液的制備

　　精密稱取天麻藥材粉末0.05g(過(guò)60目)，加入50%甲醇2mL(內(nèi)含蘆丁內(nèi)標(biāo)物質(zhì))，室溫下超聲提取(功率120W，頻率40kHz)60min，放置室溫，補(bǔ)足失重，樣品提取液13000r·min-1離心10min后，取上清液過(guò)0.2μm微孔濾膜，供UPLC-Q-TOF-MS分析用。

　　1.5 液相和質(zhì)譜條件

　　1.5.1 液相色譜條件[18-21]

　　ACQUITY UPLCR HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm，美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈(B);梯度洗脫(0~4min，0%~0.5%B;4~6min，0.5%~2%B;6~7min，2%~8%B;7~12min，8%~12%B;12~18min，12%~20%B;18~24min，20%~40%B;24~25min，40%~45%B;25~31min，45%~70%B;31~33min，70%~98%B;33~35min，98%B);流速0.5mL·min-1;柱溫40℃，進(jìn)樣體積1μL。

　　1.5.2 質(zhì)譜條件

　　Waters Xevo G2-S QTOF-MS質(zhì)譜采用電噴霧離子化源(ESI)，采用負(fù)離子檢測(cè)模式;掃描范圍m/z50~1500，掃描時(shí)間0.2s，毛細(xì)管電壓2000V，錐孔電壓40V，除溶劑氣體氮?dú)?00L·h-1，除溶劑溫度450℃，離子源溫度100℃。

　　1.6 天麻藥材5個(gè)指標(biāo)成分的相對(duì)定量分析

　　課題組在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)以蘆丁作為內(nèi)標(biāo)物不僅響應(yīng)較好，而且在其出峰位置處無(wú)干擾，成功實(shí)現(xiàn)了相對(duì)定量分析[17]。本研究以蘆丁(20.8mg·L-1)作為內(nèi)標(biāo)物，提取各天麻樣品中5個(gè)分析物的峰面積與蘆丁峰面積的比值，計(jì)算得到5個(gè)指標(biāo)成分的相對(duì)含量，用于天麻樣品間的相互比較。

　　1.7 數(shù)據(jù)處理

　　本研究采用MassLynxTM軟件(4.1，美國(guó)Waters公司)對(duì)天麻化學(xué)成分進(jìn)行分析，根據(jù)保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、對(duì)照品和同位素的豐度和分布對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。為了準(zhǔn)確鑒定化合物，分子式的參數(shù)設(shè)定：C[0~80]，H[0~150]，O[0~60]，N[0~10]，S[0~2]，P[0~2]，質(zhì)譜偏差設(shè)置為5×10-6。同時(shí)，使用內(nèi)標(biāo)物蘆丁和天麻混合樣品分別進(jìn)行相對(duì)定量和質(zhì)量控制(QC)。接下來(lái)尋找天麻藥材中的硫熏特征性差異成分，將前面采集得到的數(shù)據(jù)再依次導(dǎo)入Progenesis QI軟件(美國(guó)Waters公司)和EZinfo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

　　2 結(jié)果

        硫磺熏蒸對(duì)天麻藥材質(zhì)量的影響

　　根據(jù)分子離子峰響應(yīng)強(qiáng)度判斷，硫熏后天麻藥材中的天麻素和巴利森苷成分明顯降低，見(jiàn)圖1。推測(cè)天麻藥材中各成分的變化可能是在二氧化硫和水形成的酸性環(huán)境下，發(fā)生降解，亞磺酸化或氧化還原反應(yīng)的結(jié)果。此外，從圖1B可以發(fā)現(xiàn)，硫熏后的天麻樣品中產(chǎn)生了新的成分。根據(jù)其質(zhì)譜信息，結(jié)合其裂解碎片，發(fā)現(xiàn)該成分與課題組前期得到的天麻硫熏標(biāo)志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite(p-HS)相一致[17-18]，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

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